Внеклеточная ДНК

Все они, на первый взгляд, не имеют каких-либо общих характеристик. Однако у этих состояний действительно есть кое-что общее: наличие дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) вне клеток.

Что такое внеклеточная ДНК и каково ее клиническое применение?

Что такое внеклеточная (циркулирующая) ДНК

Циркулирующая, или свободная ДНК, представляет собой двух- или одноцепочечные молекулы ДНК длиной от 500 до 21 000 пар оснований, которые обнаруживаются в крови, моче и других жидкостях организма. В настоящее время большинство исследований сосредоточено на их обнаружении в плазме и сыворотке, поскольку они представляют собой легкодоступные жидкости, которые можно получить минимально инвазивным методом. 

Существует по крайней мере два механизма, с помощью которых ДНК может попасть в кровообращение. Их можно разделить на активные и пассивные. При пассивном механизме апоптотические и некротические клетки высвобождают ядерную и митохондриальную ДНК в кровоток в процессе разрушения клеток. 

В норме инфильтрированные фагоциты отвечают за очистку апоптотических и некротических остатков. Поэтому в целом уровни циркулирующей ДНК низкие. Однако определенные состояния, такие как опухолевая масса, воспаление или интенсивные физические нагрузки, приводят к тому, что очищение происходит неправильно, в результате чего в кровь попадает скопление клеточного мусора, включая ДНК. 

Активное высвобождение ДНК было определено исследованиями с культивируемыми клеточными линиями различного происхождения и, как полагают, вызывает спонтанное высвобождение фрагментов ДНК в кровообращение. 

Следовательно, какой бы ни был механизм выброса ДНК в кровообращение, увеличение концентрации циркулирующей ДНК в различных состояниях (патологических или нет) частично обусловлено неспособностью организма элиминировать циркулирующую ДНК.

В нормальных физиологических условиях уровень циркулирующей ДНК низкий, но резко повышается при определенных патологических состояниях, например, таких как опухолевые процессы.

Семинары по антивозрастной медицине

Получайте знания, основанные на доказательной медицине из первых уст ведущих мировых специалистов. В рамках Модульной Школы Anti-Age Expert каждый месяц проходят очные двухдневные семинары, где раскрываются тонкости anti-age медицины для врачей более 25 специальностей

Узнать подробнее

Классификация

В зависимости от происхождения выделяют три типа циркулирующей ДНК:

• Нормальная циркулирующая ДНК, образованная деградировавшими фрагментами ДНК, возникающими в результате процесса апоптоза или некроза нормальных ядросодержащих клеток организма, главным образом гемопоэтических клеток.

• Циркулирующая ДНК плода свободно циркулирует в кровотоке матери. Эта ДНК имеет преимущественно плацентарное происхождение, и ее присутствие было продемонстрировано на ранних стадиях развития (на 6 неделе беременности), когда еще нет связи между фетоматеринским кровообращением.

• Циркулирующая опухолевая ДНК, происходящая непосредственно из опухоли или циркулирующих опухолевых клеток. Ее количество увеличивается по мере продвижения стадии рака, а ее молекулярные изменения позволяют отличить ее от нормальной циркулирующей ДНК.

Циркулирующая ДНК и ее клиническое применение

Анализ циркулирующей ДНК — неинвазивный и недорогой метод, поэтому многочисленные исследования сосредоточены на его возможном клиническом применении. 

• Применение циркулирующей ДНК плода

  Свободная ДНК плода позволяет диагностировать и изучать различные точечные мутации без необходимости проведения инвазивных процедур, ставящих под угрозу здоровье матери или ребенка. Эта ДНК начинает присутствовать в материнской крови с шестой недели беременности. Несмотря на высокую степень фрагментации, в плазме матери представлен весь геном плода. Это означает, что априори любой генетический дефект можно изучить в свободной ДНК плода, присутствующей в материнской крови.

  • Определение пола плода.

  Его можно определить путем анализа циркулирующей ДНК плода. Для этого анализируются специфические последовательности Y-хромосомы по критерию присутствия/отсутствия.

  • Определение резус-фактора плода.

  Этот тест проводится, когда у матери отрицательный резус-фактор, чтобы исключить гемолитическую болезнь у новорожденного. Это заболевание характеризуется тем, что иммунная система матери во время беременности вырабатывает антитела, которые атакуют эритроциты ее собственного плода, когда у матери и ребенка разные группы крови. 

  • Определение моногенных заболеваний.

  Анализ циркулирующей ДНК плода может определить только заболевания, передаваемые отцом, поскольку с помощью современных механизмов невозможно отличить циркулирующую материнскую ДНК от копий ДНК плода матери. В этом типе заболеваний можно найти болезни доминантного и рецессивного наследования.

  Выявление доминантно наследуемых заболеваний. Этот тест применяется в тех парах, в которых мужчина является носителем мутации, связанной с доминантно наследуемым заболеванием. Отсутствие указанного дефекта в материнском геноме позволяет поставить диагноз плоду по материнской крови. Наличие или отсутствие отцовского мутантного аллеля в материнской крови позволяет сделать вывод о том, поражен или здоров плод. 

  Выявление рецессивных наследственных заболеваний. В этом случае отсутствие у плода отцовского рецессивного гена позволяет избежать необходимости инвазивной пренатальной диагностики. В случае обнаружения этого гена отцовского происхождения в циркулирующей ДНК плода потребуется инвазивная пренатальная диагностика.

  • Исследование анеуплоидий плода.

  Анеуплоидии — это изменения числа хромосом, которые приводят к потере или приобретению полных хромосом. Пренатальная диагностика анеуплоидий плода требует инвазивных процедур, рискованных и дорогостоящих. Анализ циркулирующей ДНК плода позволяет обнаружить трисомии 13, 18 и 21.  На сегодняшний день достигнут уровень обнаружения 99%, а уровень ложноположительных результатов составляет менее 0,1%. Однако важно подчеркнуть, что на данный момент не рекомендуется использовать этот метод в качестве диагностического инструмента, а скорее, его использование рекомендуется в качестве инструмента скрининга.

• Применение нормальной циркулирующей ДНК

  • Биомаркер отторжения трансплантата органов.

  Нормальную циркулирующую ДНК можно использовать для мониторинга эволюции органа после его имплантации пациенту. Для этого предполагается, что отторжение вызовет иммунную реакцию реципиента против имплантируемого органа, что приведет к высокой смертности клеток имплантируемого органа. В результате гибели клеток ДНК выбрасывается в кровоток.

  Для мониторинга проводится количественная оценка свободной ДНК трансплантата, что позволяет выявлять эпизоды отторжения на ранних стадиях, когда другие диагностические методы не эффективны. Это неинвазивный метод, который позволяет осуществлять мониторинг через определенные промежутки времени, чтобы выявить отторжение на начальных этапах и избежать полного отторжения в дальнейшем.

  Этот биомаркер может быть особенно ценным для минимизации иммуносупрессии. В настоящее время проводятся исследования печени, сердца и почек для налаживания такого мониторинга в клиниках.

  • Мониторинг лечения системной красной волчанки.

  Системная красная волчанка (СКВ) — хроническое аутоиммунное заболевание. Как и при других аутоиммунных заболеваниях, недавние исследования показали высокий процент циркулирующей ДНК у пациентов с СКВ. Поскольку большинство таких нарушений связано с увеличением частоты случаев гибели клеток из-за апоптоза или некроза, эти механизмы считаются основными источниками циркулирующей ДНК. Снижение уровня циркулирующей ДНК также наблюдалось после терапии у тех пациентов, которые позитивно отреагировали на лечение. Это открывает возможность использования этой ДНК в качестве маркера для мониторинга лечения СКВ.

  • Прогноз и мониторинг травмы.

  Высокие уровни циркулирующей ДНК могут быть маркером гибели клеток в результате их повреждений. Например, концентрации ДНК были изучены в крови людей, у которых был диагностирован инфаркт миокарда — состояние, которое начинается с недостатка кислорода и может привести к некрозу. У них наблюдался более высокий уровень внеклеточной ДНК, чем у здоровых людей. Кроме того, высокие концентрации циркулирующей ДНК могут быть связаны с тяжестью травмы и развитием посттравматических осложнений. 

• Применение циркулирующей опухолевой ДНК

  Она представляет собой молекулы ДНК, выделяемые опухолями в жидкости организма. Анализ этой ДНК может дать большую часть той же информации, что и биопсия ткани. При многих опухолях биопсия ткани является сложной задачей, поскольку она дорогостоящая, болезненная или потенциально рискованная для пациента.

  Жидкостная биопсия основана на анализе ДНК опухоли, циркулирующей в крови; кровь — очень доступная жидкость, и ее извлечение минимально инвазивно. Поскольку циркулирующая опухолевая ДНК отражает геном опухоли, она имеет большой потенциал в качестве клинического инструмента. Кроме того, благодаря новым технологиям чувствительность и специфичность обнаружения циркулирующей ДНК опухолей были улучшены.

  • Раннее выявление рака.

  Потенциальным применением жидкой биопсии на основе циркулирующей опухолевой ДНК является обнаружение рака на ранних стадиях. В нескольких исследованиях жидкая биопсия выявила циркулирующую опухолевую ДНК в образцах крови, взятых у пациентов за несколько месяцев до того, как у них развилось заболевание.

  Проблема, однако, в том, что иногда случаются ложноположительные результаты: обнаружение раковой ДНК тогда, когда рак впоследствии не развивается. 

  • Выявление рецидива при локализованном раке.

  Еще одним потенциальным клиническим применением жидкой биопсии является раннее обнаружение рецидива локализованного рака после лечения.

  Имеются исследования, которые показывают, что путем мониторинга опухолеспецифических генетических изменений в плазме больных колоректальным раком после операции можно выявить рецидив заболевания практически со 100% чувствительностью и специфичностью. Пациенты с остаточной болезнью также были идентифицированы на основании стойких,связанных с опухолью, изменений в циркулирующей ДНК.

  • Прогнозирование ответа на лечение при метастатическом раке.

  Есть надежда, что анализ циркулирующей опухолевой ДНК может помочь в принятии решений относительно точного медицинского лечения путем выявления уникальных молекулярных характеристик человека с метастатическим раком. В нескольких исследованиях жидкая биопсия выявила мутации циркулирующей опухолевой ДНК, которые потенциально могут быть использованы для определения оптимального лечения. Кроме того, все большее число генетических изменений тестируются в качестве предполагаемых прогностических биомаркеров в клинических испытаниях новых противораковых методов лечения.

  Обнаружение растущего числа копий генов также можно использовать для оценки амплификации других генов и прогнозирования ответа на лечение.

  • Идентификация механизмов резистентности при рефрактерном раке.

  Развитие вторичной приобретенной резистентности часто встречается у большинства пациентов, получающих таргетные препараты. Каждому пациенту, у которого появляется резистентность к определенной терапии, следует провести биопсию тканей. Впоследствии, используя молекулярные инструменты, ткань до терапии сравнивается с тканью после терапии. Этот анализ проводится на поздних стадиях рака и в идеале позволяет получить профиль преобладающего резистентного клона исследуемого поражения.

  Существуют исследования, которые показали, что обнаружение новых резистентных клонов благодаря наличию связанных с опухолью генетических изменений в крови выявляет устойчивость к лечению за 10 месяцев до рентгенологических методов.

  • Мониторинг ответа при метастатическом раке.

  Жидкостная биопсия на основе циркулирующей опухолевой ДНК, легко воспроизводимая и неинвазивная, может быть полезна для мониторинга реакции пациентов на терапию во время лечения и после его завершения. Другими словами, лечение может быть остановлено или скорректировано, если анализы покажут, что оно не работает должным образом.

Внеклеточная ДНК и старение

Учитывая все более стареющее население мира (число людей старше 80 лет утроится к 2050 году), в последние годы многочисленные исследования направили свои усилия на увеличение продолжительности здоровой жизни. Важным моментом в поиске рецепта того, как жить дольше и лучше, является наличие биомаркеров, которые информируют исследователей и специалистов-клиницистов о том, насколько быстро или медленно человек стареет на биологическом уровне. С этой целью группа исследователей из Университета Брауна в США и Университета Болоньи в Италии предложила внеклеточную ДНК в качестве потенциального биомаркера здорового старения.

Жидкостная биопсия открывает большие возможности для изучения различных факторов здоровья и физиологического состояния человека. Когда клетки умирают, независимо от того, происходит ли это из-за болезни или в результате естественного физиологического процесса, часть их наследственного материала, их ДНК, высвобождается в кровоток. Эта свободная ДНК, присутствующая в плазме, может информировать исследователей о существовании рака, если она имеет определенные эпигенетические профили или содержит специфические мутации, отсутствующие в здоровых клетках. Точно так же циркулирующая ДНК может сообщать об избыточном воспалении, например, о том, которое характеризует старение. С другой стороны, жидкая биопсия предлагает способ забора информативных образцов без необходимости прибегать к более инвазивным методам.

Исследователи сравнили свободную ДНК, циркулирующую в плазме молодых мужчин и женщин, а также людей в возрасте около 70 лет и долгожителей. Изучались как люди с относительно хорошим здоровьем, так и больные. В результате были обнаружены различия в том, как ДНК “упакована” у этих групп.

В частности, команда проанализировала закономерности фрагментации циркулирующей ДНК, чтобы определить, каким было распределение нуклеосом (основной единицы уплотнения ДНК) в клетках, из которых ДНК была высвобождена в плазму. Часть цепи ДНК, которая уплотнена вокруг белков-гистонов в нуклеосоме, более защищена от расщепления ДНК, происходящего во время апоптоза или гибели клеток, поэтому анализ размера свободных фрагментов ДНК, циркулирующих в крови, может дать информацию о распределении нуклеосом. 

 Ученые обнаружили, что пространство между нуклеосомами становится более неравномерным по мере увеличения возраста людей. Кроме того, сигналы уплотнения нуклеосом, полученные у здоровых долгожителей, больше похожи на сигналы 20-летних, чем у 70-летних.

То есть, здоровые долгожители сохраняют эпигеномные профили более молодых людей.

Аналогичным образом, анализируя последовательность фрагментов, исследователи обнаружили, что с возрастом происходит потеря свободно циркулирующей ДНК в различных областях генома, таких как области инициации или терминации транскрипции. То же самое происходит с некоторыми мобильными элементами генома, которые больше не контролируются и могут перемещаться по геному, изменяя его функциональный баланс.

В последнее время широко изучается анализ свободной ДНК, циркулирующей в крови, для выявления наличия рака, его происхождения или даже реакции на химиотерапию. Недавнее исследование, опубликованное в журнале Aging Cell , является первым доказательством того, что свободная ДНК может использоваться в качестве биомаркера старения. 

В настоящее время исследователи работают над улучшением процесса выделения циркулирующей свободной ДНК и оптимизации анализа. Кроме того, они планируют проанализировать большее количество образцов, чтобы подтвердить полезность циркулирующей свободной ДНК в качестве биомаркера, а также оценить другие эпигенетические механизмы с целью определить, из какого типа клеток или ткани именно циркулирующая свободная ДНК происходит на разных стадиях. 

Эта информация может значительно улучшить знания о клеточных процессах, связанных со старением, что, в свою очередь, является необходимым шагом для определения терапевтических стратегий, направленных на продление здоровой жизни.

Исследования внеклеточной ДНК

Открытия, касающиеся циркулирующей ДНК и ее возможной связи с некоторыми патологиями, вызвали большой интерес исследователей к потенциалу циркулирующей ДНК. Основное внимание уделяется диагностике, прогнозированию и мониторингу различных клинических состояний.

Главной целью проведения таких исследований была замена инвазивных диагнозов. Для этого необходимо достичь уровня чувствительности и специфичности 100%. Поскольку эти значения не достигаются, неинвазивную диагностику начинают рассматривать уже не как диагностический метод, а как инструмент скрининга.

Необходимо добиться большего технического прогресса, унифицировать используемые методологии и расширить исследования в области циркулирующей ДНК. Ее изучение может стать важным и мощным клиническим инструментом при оценке рака, а также других заболеваний и состояний здоровья: осложнений беременности, трансплантаций и травм.

Онлайн обучение
Anti-Age медицине

Изучайте тонкости антивозрастной медицины из любой точки мира. Для удобства врачей мы создали обучающую онлайн-платформу Anti-Age Expert: Здесь последовательно выкладываются лекции наших образовательных программ, к которым открыт доступ 24/7. Врачи могут изучать материалы необходимое количество раз, задавать вопросы и обсуждать интересные клинические случаи с коллегами в специальных чатах

Узнать подробнее

Краткие выводы

• Циркулирующая (внеклеточная) ДНК, представляет собой двух- или одноцепочечные молекулы ДНК длиной от 500 до 21 000 пар оснований, которые обнаруживаются в крови, моче и других жидкостях организма.

• Чрезмерно активный выброс ДНК в кровообращение может свидетельствовать о наличии патологии (например, онкологии). 

• Анализ циркулирующей ДНК — неинвазивный и недорогой метод, поэтому многочисленные исследования сосредоточены на его возможном клиническом применении. 

• Недавнее исследование, опубликованное в журнале Aging Cell, является первым доказательством того, что свободная ДНК может использоваться в качестве биомаркера старения. 

• Выявление и изучение внеклеточной ДНК может стать важным и мощным клиническим инструментом при оценке рака, а также других заболеваний и состояний здоровья: осложнений беременности, трансплантаций и травм.

Список использованной литературы

1. Anker, P., H. Mulcahy y M. Stroun (2003), “Circulating nucleic acids in plasma and serum as a noninvasive investigation for cancer: time for large-scale clinical studies?”, International journal of cancer, 103, 2.

2. Atamaniuk, J., C. Vidotto, H. Tschan, N. Bachl, K.Stuhlmeier y M. Müller (2004), “Increased concentrations of cell-free plasma DNA after exhaustive exercise”, Clinical chemistry, 50.

3. Bianchi, D. (2004), “Circulating fetal DNA: its origin and diagnostic potential –a review”, Placenta, 25, Supplement A, “Trophoblast research”, 18.

4. Johnson, P. y D. Lo (2002), “Plasma nucleic acids in the diagnosis and management of malignant disease”, Clinical chemistry, 48, 8.

5. Lui, Y. y D. Lo (2002), “Circulating DNA in plasma and serum: biology, preanalytical issues and diagnostic applications”, Clinical chemistry and laboratory medicine, 40, 10. 

6. Lui, Y., K. Woo, A. Wang, C. Yeung, P. Li, E. Chau, P.Ruygrok y D. Lo (2003), “Origin of plasma cell-free DNA after solid organ transplantation”, Clinical chemistry, 49, 3.

7. Trejo-Becerril, C., E. Pérez-Cárdenas, H. Treviño-Cuevas, L.Taja-Chayeb, P. García-López, B. Segura-Pacheco, A.Chávez-Blanco, M. Lizano-Soberón, A. González-Fierro, I. Mariscal, T. Wegman-Ostrosky y A. Dueñas-González (2003), “Circulating nucleosomes and response to chemotherapy: an in vitro, in vivo and clinical study on cervical cancer patients”, International journal of cancer, 104. 

8. Ziegler, A., U. Zangemeister-Wittke y R. Stahel (2002), “Circulating DNA: a new diagnostic gold mine?”, Cancer treatment reviews, 28.