Бактериофаги: особенности и применение в медицине

Что такое бактериофаги

Бактериофаги (также известные как фаги) — это вирусы, которые которые заражают бактерии с очень высокой специфичностью. Например, фаг не только нацелен на конкретный вид в пределах рода, но и обычно нацелен на очень специфическое подмножество бактериальных штаммов в пределах вида. 

Фаги являются наиболее распространенными биологическими объектами на планете Земля и обнаруживаются в различных средах, например, в фекалиях человека и животных, почве, воде и т. д. Более того, их жизненный цикл дает им возможность проникать в патогенные бактерии (микроорганизмы, которые могут вызывать инфекционные заболевания), ища подходящий момент для их уничтожения.

Бактериофаги, как и все вирусы, ведут внутриклеточную жизнь. Они активно участвуют в жизни бактерий, кодируя также выработку ферментов и токсинов,при переносе генов между бактериями, изменяя их патогенность. Большинство из них содержат дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и в соответствии с морфологией, видимой под электронным микроскопом, классифицируются как икосаэдрические, с хвостом и нитевидные.

За последнее десятилетие в международной литературе публиковались статьи, демонстрирующие различные практические применения бактериофагов. Например, одна не недавних тенденций — поиск бактериофагов E. coli в уже очищенной питьевой воде в качестве контроля качества процесса очистки.

Промышленность, занимающаяся производством протезов, обеспокоенная бактериальным загрязнением во время процесса имплантации или после него, предлагает смесь («коктейль») различных бактериофагов сапрофитных или патогенных бактерий, которыми они покрывают протез слоем, чтобы уничтожить загрязняющие вещества. 

Пищевая промышленность молочной и мясной продукции не новичок в использовании бактериофагов. Здесь используют фаги или производимые ими ферментные производные для предотвращения заражения бактериями Listeria monocitogenes, которые обладают свойством размножаться при низкой температуре.

Разумеется, применению фагов нашлось место и в медицине. На этом аспекте остановимся чуть позже. 

История открытия

Слово «бактериофаг» происходит от французского bactériophage, слова, образованного двумя греческими элементами: бактерии + фаги, «которые поедают бактерии». 

В 1673 году натуралист Антони ван Левенгук впервые увидел живые клетки под микроскопом. В 1892 году Димитрий Иосифович Ивановский открыл первый вирус — вирус табачной мозаики. В 1898 году британский химик и микробиолог Эрнст Ханбери Ганкин сообщил о литическом действии воды из рек Ганг и Джум, пропущенной через бактериальные фильтры, на возбудителей холеры. Считал, что это связано с летучим бактерицидным веществом. 

В 1898 году российский и советский врач, микробиолог и эпидемиолог Николай Федорович Гамалея сообщил о «литическом ферменте», выделенном из лизата культур Baclillus anthracis. Вероятно, это были бактериофаги. 

В 1915-м Фредерик Уильям Туорт впервые наблюдал лизис бактерий фагами. В 1917 году произошло повторное открытие вирусов бактерий и введение термина «бактериофаг» Феликсом д’Эреллем. 

В 1940-е получены первые изображения бактериофагов под электронным микроскопом. Ученые убедились — фаги существуют.

Открытие бактериофагов представляет собой одно из важнейших достижений ветеринарии и медицины 20-го века, поскольку в настоящее время они считаются звеном эволюции (Talavera-Gonzalez et al., 2021). 

Кроме того, они играют очень важную роль в природе, поскольку поддерживают ее баланс, борясь с патогенными бактериями и тем самым предотвращая возникновение крупных эпидемий бактериального происхождения.

Исследования фагов надолго были остановлены различными факторами, такими как открытие пенициллина Александром Флемингом в 1928 году. Однако исследования фагов продолжались в России, Грузии и Польше, и сегодня эти страны считаются лидерами по мнению и применению фаготерапии (для лечения бактериальных заболеваний).

В середине прошлого века бактерии и фаги использовались в экспериментах, проясняющих основные вопросы биологии и генетики. Благодаря своей бактерицидной активности и неспособности заражать эукариотические клетки, фаги могли использоваться в борьбе с инфекционными заболеваниями. Идея не нова, но развитие этого вида терапии сдерживалось недостаточно контролируемыми испытаниями и открытием новых антибиотиков. Однако в настоящее время развитию фаговой терапии могут способствовать более простые методы биоинженерии. Кроме того, биоразнообразие фагов в природе может быть использовано в качестве преимущества для идентификации и разработки фагов, которые идеально подходят для борьбы с определенными бактериями.

Состав и структура бактериофага

Бактериофаги имеют переменные размеры, диаметр обычно составляет 23–30 нм. Хотя состав фагов может отличаться, все они содержат нуклеиновую кислоту и белок.

В зависимости от фага нуклеиновая кислота может представлять собой либо ДНК, либо РНК. Нуклеиновые кислоты фага часто содержат редкие или модифицированные основания. Они защищают нуклеиновые кислоты фага от эндонуклеаз, которые расщепляют нуклеиновые кислоты хозяина во время инфекции. Размер нуклеиновых кислот варьируется в зависимости от фага. У простейших фагов нуклеиновой кислоты — для кодирования в среднем 3–5 генных продуктов, тогда как наиболее сложные фаги могут кодировать более 100 генных продуктов.

Число белков разных классов и количество каждого из них в фаговой частице будет варьироваться в зависимости от класса рассматриваемого фага. Самый простой фаг обладает несколькими копиями только одного или двух разных белков, тогда как наиболее сложные могут содержать множество различных типов белков. Функция белков при инфекции заключается в защите нуклеиновой кислоты от нуклеаз ее окружения.

• Структура

  Схематично она выглядит так (сверху вниз):

  • Голова или капсид. Классические фаги имеют головчатую структуру и могут различаться по размеру и форме. Некоторые из них икосаэдрические (20 граней), другие нитевидные. Головка или капсид состоит из множества копий одного или нескольких различных белков. Внутри головы находится геном бактериофага в виде нуклеиновой кислоты. Головка действует как защитное покрытие для нуклеиновой кислоты.

  • Хвост. Многие фаги имеют хвост, прикрепленный к головке. Хвост представляет собой полую трубку, через которую проходит нуклеиновая кислота при заражении. Размер хвоста может варьироваться. На конце хвоста более сложные фаги, такие как Т4, имеют у основания пластинку и одно или несколько прикрепленных к ней волокон. Эта базовая пластинка и хвостовые волокна участвуют в прикреплении фага к бактериальной клетке. Не все фаги имеют базовые пластинки или хвостовые волокна. В таких случаях существуют другие структуры, связанные с прикреплением фаговой частицы к бактериям.

Геном бактериофагов состоит из ДНК или РНК, двух- или одноцепочечной.

Классификация и механизм действия

Классификация бактериофагов зависит от ряда характеристик, особенно от биологического цикла. 

Большинство фагов относятся к порядку Caudovirales, которые являются хвостатыми вирусами (cauda — латинское слово, означающее «хвост») и, согласно схеме классификации Балтимора, являются вирусами группы I с двухцепочечной ДНК (dsDNA) для своего генома, длиной от 3400 до 500 000 пар оснований.

Другие типы фагов включают спиральные, изометрические и плеоморфные вирусы, хотя они составляют меньшинство. Изометрические фаги могут иметь любой тип генома, тогда как плеоморфные и спиральные фаги обычно содержат геномы dsDNA.

Жизненный цикл фага включает его связывание с рецептором бактерии, что приводит к высвобождению генетического содержимого фага в бактерию. Это связывание происходит после распознавания рецептора бактерии, что позволяет фагу прикрепиться к бактериальной клетке и проникнуть в нее. Эти рецепторы обычно представляют собой белки или сахара на бактериальных клетках, распознаваемые белками фагов, которые опосредуют их адгезию на бактериальной клетке, что приводит к проникновению в бактериальную клетку.

После связывания фага с бактериальным рецептором и инъекции генома в клетку генетический материал фага использует молекулярный аппарат бактерии-хозяина и подвергается транскрипции, трансляции и репликации, что приводит к образованию необходимых компонентов новых фагов, которые в дальнейшем высвобождаются с сопутствующим лизисом бактерии. Затем этот процесс далее повторяется новыми вирусными частицами после заражения новых бактериальных клеток. 

Существуют два различных типа фагов с точки зрения пролиферации, которые имеют клиническое значение. Один из них тип — литические фаги, которые всегда следуют ранее упомянутому циклу при заражении бактерии, что приводит к разрушению бактерий и сопутствующей пролиферации фагов. 

Другой тип фагов — лизогенные, которые интегрируют свой генетический материал в бактериальный геном и не обязательно приводят к лизису бактерий сразу после заражения бактериальной клетки. Затем геном фага наследуется дочерними бактериальными клетками посредством бинарного деления, и при определенных экологических или физиологических стрессорах, которые отрицательно влияют на приспособленность бактериальной клетки-хозяина, фаг начинает литический цикл. 

Литические фаги кажутся более подходящими для клинического использования, поскольку ожидается, что они с большей готовностью вызовут бактериальное повреждение в более высокой степени, в то же время они также имеют теоретическое преимущество в том, что они более безопасны по сравнению с лизогенными фагами, поскольку они не включают перенос генов. Кроме того, лизогенные фаги могут быть полезны в других областях, таких как мониторинг опухолей. 

Бактериофаги в медицине

Бактериофаги считаются естественными хищниками бактерий, а в некоторых случаях их использовали в качестве потенциальных терапевтических агентов. 

Примерно в середине 20-го века начала зарождаться идея использования фагов в качестве медицинской терапии, особенно в бывшем Советском Союзе, в частности благодаря микробиологу Джорджу Элиаве. Фундаментальным был также вклад уже упомянутого Феликса д'Эреля, который в 1930 году в Джорджии основал институт по изучению бактериофагов. Появление антибиотиков в 1940-х годах помешало развитию этого направления.

Однако начиная с 1990-х годов возобновился интерес к использованию фагов в качестве терапевтических средств.

Преимущество терапии фагами в том, что она имеет низкий риск. Они растут быстро и экспоненциально, что ограничивает дозы вводимых фагов и способствует росту мутантных штаммов с большей антибактериальной активностью.

Введение происходит с помощью аэрозолей (воздушно-капельным путем), а, например, также с использованием примочек и турунд. Фаги быстро распространяются по организму, выполняя свою функцию.

Пределы определяются открытием токсинов в фаговых препаратах и ​​развитием у бактерий устойчивости к фагам, хотя и гораздо более низкой, чем у антибиотиков. Кроме того, поиск фагов, действующих против конкретного штамма бактерий, поражающего наш организм, чрезвычайно затруднен.

Недавнее использование генетически модифицированных фагов произошло в 2018 году в Лондоне. Семнадцатилетняя Изабель Холдэуэй страдала муковисцидозом и после двойной трансплантации легких рисковала жизнью из-за инфекции, вызванной Mycobacterium abscessus, устойчивой к антибиотикам.

После нескольких месяцев бесполезного лечения педиатр обратился к опытным вирусологам, которые создали коктейль фагов для лечения инфекции пациентки, которая через несколько месяцев полностью выздоровела.

Положительный результат, произошедший в случае Изабель, не означает, что его можно ожидать и у других пациентов.

На сегодняшний день существует множество научных подтверждений эффективности бактериофагов. Они широко используются при лечении внутрибольничной инфекции, инфекции под биопленкой, инфекции мочеполовой системы, а также органов дыхания, ожогов и ран, трофических язв, при остеомиелите, гнойных заболеваниях кожи и слизистых.

Бактериофаги также полезны в лабораторной диагностике для идентификации патогенных бактерий (фаготипирование). Хотя фаговое типирование не используется в рутинной клинической лаборатории, оно используется в референс-лабораториях в эпидемиологических целях. В последнее время возник новый интерес к возможному использованию бактериофагов для лечения бактериальных инфекций и профилактики. Таким образом, решение о том, будут ли бактериофаги использоваться в клинической медицине, еще не принято. 

Бактериофаги и антибиотики

Бактериофаги имеют преимущества перед антибиотиками. Выделим некоторые из них:

• Они высокоспецифичны, поскольку каждый бактериофаг селективен в отношении определенного вида бактерий или даже определенных штаммов бактерий. Эта особенность очень важна, поскольку таким образом бактерии, ответственные за инфекцию, являются единственными мишенями терапии, а микробы, составляющие бактериальную флору человека, не погибают, как в случае с обычными антибиотиками. Все это приводит к уменьшению побочных эффектов, вызываемых многими антибиотиками, таких как, например, диарея.

• Благодаря лизису бактерий бактериофаги косвенно стимулируют иммунную систему. Фактически, бактериальный лизис генерирует клеточные фрагменты, которые распознаются клетками нашей иммунной системы. Таким образом, это явление позволяет активировать все защитные механизмы организма.

  Может случиться так, что бактерии также выработают устойчивость к бактериофагам, однако если это произойдет, фаги потенциально способны быстро создать новый штамм, способный снова атаковать бактерии.

  Когда бактерии, вызывающие инфекцию, уничтожаются, бактериофаги также исчезают. 

• Потенциал для персонализированного лечения. Одним из самых замечательных аспектов фаговой терапии является ее адаптируемость к индивидуальным пациентам. При столкновении с бактериальными инфекциями, устойчивыми к нескольким антибиотикам или обладающими уникальными характеристиками, фаговую терапию можно персонализировать. Выделив и идентифицировав инфицирующие бактерии, поставщики медицинских услуг могут выбрать наиболее подходящие фаги для борьбы с конкретным штаммом, вызывающим инфекцию. Такой персонализированный подход повышает шансы на успешное лечение, особенно в случаях, когда традиционные антибиотики неэффективны.

• Низкая токсичность. Бактериофаги, как правило, считаются безопасными для использования человеком. Это природные вирусы, которые эволюционировали вместе с бактериями на протяжении многих веков. Клинические исследования и историческое использование показали, что фаги обладают низкой токсичностью для человека. Эта характеристика сводит к минимуму риск неблагоприятных побочных эффектов, обычно связанных с определенными антибиотиками. Хотя существуют некоторые опасения относительно потенциальных иммунных реакций на фаги, они, как правило, мягкие и управляемые, что еще больше подтверждает профиль безопасности фаговой терапии.

• Экологические преимущества. В отличие от антибиотиков, которые могут накапливаться в окружающей среде и способствовать развитию устойчивых к антибиотикам бактерий в различных экосистемах, бактериофаги оказывают минимальное воздействие на окружающую среду. Фаги — это естественные сущности, которые встречаются в почве, воде и других средах. Они не вносят синтетические химикаты в экосистемы и являются биоразлагаемыми. Этот экологически безопасный аспект соответствует растущему осознанию необходимости устойчивых и ответственных методов лечения. 

Однако, несмотря на важные преимущества, бактериофаги также могут иметь некоторые недостатки:

• Поскольку бактериофаги обладают высокой специфичностью в отношении определенных типов бактерий, препарат на основе фага, используемый для лечения конкретных инфекций, должен быть адаптирован для каждого конкретного пациента. Поэтому необходимо точно определить, какие бактерии ответственны за инфекцию. Это может вызвать проблемы, особенно когда жизнь пациента находится под угрозой и нет времени провести соответствующие анализы для точного выявления бактерий, вызывающих инфекцию.

• Может происходить передача бактериальных генов между одним штаммом вируса и другим.

• После лизиса бактерий в организм может выделяться чрезмерное количество токсинов, что приводит к гиперстимуляции иммунной системы; это может вызвать наступление токсического шока.

В любом случае, несмотря на недостатки, бактериофаговая терапия представляет собой интересную альтернативу антибиотикотерапии.

Самым большим препятствием, вероятно, является способ разработки фаговых препаратов. Фактически, их можно получить в относительно короткие сроки, исходя из веществ, встречающихся в природе (таких, как, например, речная вода). Однако эти методики приготовления не соответствуют правилам, регулирующим разработку и использование новых лекарств.

Будущее фаготерапии

Чем больше мы узнаем о бактериофагах, тем больше вопросов возникает.

Успешные отдельные клинические случаи обнадеживают, однако необходимо провести крупномасштабные контролируемые клинические исследования. По состоянию на март 2021 года во всем мире проводятся как минимум 12 клинических испытаний фаготерапии. Несомненно, они придут к важным выводам. 

В качестве доказательства возобновления интереса к бактериофвагам Европейское сообщество также профинансировало исследовательский проект под названием PhagoBurn (2013–2017) для оценки клинического потенциала использования фагов для борьбы с инфекциями Escherichia Coli и Pseudomonas aeruginosa при ожоговых ранах. Несмотря на технические и бюрократические трудности при завершении проекта и связанных с ним клинических испытаний, сообщалось об обнадеживающих результатах и ​​никаких побочных эффектов не наблюдалось. 

Профиль безопасности бактериофагов положительный. Нет никаких признаков аллергических реакций, которые могут возникнуть, например, при приеме антибиотиков. Однако необходимо узнать больше об их взаимодействии с клетками человека и с бактериями, которые они заражают.

С практической точки зрения необходимо установить оптимальные дозы и пути введения. Стоит попытаться выявить наиболее благоприятные комбинации с антибиотиками. Наконец, необходимо создать правовую основу, необходимую для регулирования его использования.

Краткие выводы

• Бактериофаги — вирусы, паразитирующие на бактериях.

• Они используются в медицине для лечения и профилактики бактериальных инфекций.

• Преимущества бактериофаговой терапии: специфичность, стимуляция иммунной системы, отсутствие побочных эффектов.

• Недостатки бактериофаговой терапии: необходимость определения бактерий, вызывающих инфекции, возможность передачи бактериальных генов, гиперстимуляция иммунной системы.

Список использованной литературы

1. Hatfull GF, Hendrix RW. Bacteriophages and their genomes. Curr Opin Virol. 2011 Oct;1(4):298-303. 

2. Doore SM, Fane BA. The microviridae: Diversity, assembly, and experimental evolution. Virology. 2016 Apr;491:45-55.

3. Ptashne M. Lambda's switch: lessons from a module swap. Curr Biol. 2006 Jun 20;16(12):R459-62.

4. Boyd EF. Bacteriophage-encoded bacterial virulence factors and phage-pathogenicity island interactions. Adv Virus Res. 2012;82:91-118. 

5. Watson BNJ, Staals RHJ, Fineran PC. CRISPR-Cas-Mediated Phage Resistance Enhances Horizontal Gene Transfer by Transduction. mBio. 2018 Feb 13;9.

6. De Sordi L, Lourenço M, Debarbieux L. The Battle Within: Interactions of Bacteriophages and Bacteria in the Gastrointestinal Tract. Cell Host Microbe. 2019 Feb 13;25(2):210-218. 

7. Christin JR, Beckert MV. Origins and Applications of CRISPR-Mediated Genome Editing. Einstein J Biol Med. 2016;31(1-2):2-5. 

8. Maciejewska B, Olszak T, Drulis-Kawa Z. Applications of bacteriophages versus phage enzymes to combat and cure bacterial infections: an ambitious and also a realistic application? Appl Microbiol Biotechnol. 2018 Mar;102(6):2563-2581. 

9. Pham TD, Nguyen TH, Iwashita H, Takemura T, Morita K, Yamashiro T. Comparative analyses of CTX prophage region of Vibrio cholerae seventh pandemic wave 1 strains isolated in Asia. Microbiol Immunol. 2018 Oct;62(10):635-650.